Bioss讲堂|优化流式实验的几点建议

来源: 北京博奥森生物技术有限公司   2019-5-31   访问量:409评论(0)

为何优化流式实验?

流式细胞术(FCM)工作流程中的所有步骤对获取可发表的高品质图像都至关重要。尤其是利用正确的抗体去识别抗原以及放大信号是实现最佳显示的关键。每年不断有高分文献引用Bioss流式抗体。

在选择好抗体,设置好对照之后结果仍不理想,可以从以下三方面考虑优化细节:

一、优化抗体使用浓度

图1.为细胞对不同浓度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色结果,可以看出抗体使用量不同时,阳性峰偏移程度有所不同。

图1。 细胞对不同浓度的BMAL1(bs-3750R)、Jak3(bs-2808R)染色结果

抗体滴定方法

用同种细胞,相同细胞数量与反应体积,加入不同量的抗体计算阳性峰荧光强度及信噪比(S/N>3)。

1、滴定的浓度范围尽量大,至少5个左右。

2、滴定实验条件要和实际实验条件一致,如反应温度、pH等。

3、弱表达或不分群的抗原不适合做滴定。

二、排除死细胞

如图2.所示,死细胞的自发荧光水平很高,且容易摄取抗体导致非特异性结合,最终影响实验结果;还可能会释放DNA,DNA非常粘稠,会导致细胞成团,容易堵塞管路。

图2. 全部细胞(All)与活细胞(Live)自发荧光区别

区分死细胞的方法

死细胞特性:细胞膜渗透性增强,失去膜完整性

DNA结合染料: PI, DAPI, 7-AAD, TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞,结合到细胞的DNA上,图3. 门R3中为7-AAD阴性,即为活细胞。

蛋白结合染料:结合细胞表面或膜内的游离胺,活细胞弱阳,死细胞强阳。可以用在固定标本中的,区分样本固定细胞状态。

图3. 小鼠脾细胞7-AAD染色结果

三、封闭Fc受体

Fc受体是指细胞表面能够与免疫球蛋白(IgG、IgA、IgM、IgE和IgD)结合的分子,存在于NK 细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的表面。FcR 能够与抗体的Fc段结合,在检测时产生假阳性,图4. 为FcR 封闭前后阳性结果对比。

图4. FcR封闭前后阳性峰对比

FC受体封闭试剂

商品化的 Fc Block试剂:重组人 IgG,小鼠 CD16/CD32 抗体。

人血清或相应物种的血清

四、Bioss检测案例

图5. 小鼠脾脏T cell、B cell分析

五、Bioss技术服务

本服务项目主要是利用流式细胞仪和荧光标记抗体对客户提供的细胞样品或全血样品进行检测分析。可检测的项目有:细胞周期检测、细胞凋亡检测、免疫细胞分型、细胞表面抗原鉴定、同城上机检测。

六、流式抗体部分高分文献



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